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【导语：诺奖得主Jennifer Doudna团队在AI蛋白质设计领域取得重大突破，于顶刊Science发表成果。他们创造出新型基因编辑蛋白SynTnpB，部分变体活性超天然酶，还揭示其结构，不过该技术仍有不足待完善。】

AI策略突破RNA引导核酸酶设计困境

目前，CRISPR - Cas技术虽能精准编辑DNA/RNA，但设计自然界不存在且有活性的RNA引导核酸酶并非易事。现有序列模型生成的酶接近天然序列，结构引导设计难在改写序列时保留活性。而Doudna团队提出结合结构与进化信息的AI蛋白设计策略，选择小型RNA引导核酸酶TnpB作为设计对象。

在设计模块，先采用ESM逆折叠模型（ESM - IF1）根据TnpB三维结构生成候选序列，同时基于进化信息构建序列掩码，固定部分残基，其余交由ESM - IF1重新设计。在筛选模块，用细菌ccdB毒素系统筛选活性变体，拆分测试TnpB的REC和NUC两个结构域，发现NUC更耐受序列变化，最终在1980个REC - NUC组合中筛出9个高活性、高多样性的变体。

SynTnpB变体活性超越天然酶

AI设计的SynTnpB变体在细菌、植物和人类细胞中表现出色，甚至超越天然酶。在人类和植物细胞编辑实验中，将9个变体放入HEK293T细胞和拟南芥原生质体验证，在人类细胞中，多数变体活性与野生型相当，v1和v5表现最佳，最高编辑率达到50%，约为野生型的1.8倍；在植物细胞实验中，v1同样在多数测试靶点上优于野生型。

从特异性和生化表征来看，SynTnpB变体保留了典型TTGATTAM偏好，但脱靶表现因变体而异。全基因组Tn5标签化分析显示，v1的特异性与野生型相当，v5和v7检测到更多脱靶位点。各变体表达水平与编辑活性不相关，以v7变体为例，其热稳定性与野生型相当，保留较强靶链切割活性，但切割反应较野生型有所减慢。

冷冻电镜结构显示，AI生成的残基在多个结构域与RNA - DNA形成新接触，稳定不同构象状态下的界面。选择序列分化程度较高的v7进行解析，其与野生型序列一致性为77%，在RUNX1位点显示较高编辑效率，冷冻电镜结构分辨率达到2.8 Å，并捕获到TAM结合状态和R - loop形成状态两种构象，其中TAM结合状态的构象中间体此前未在TnpB中观察到。

技术不足与未来发展方向

尽管该方法有望推广到更多RNA引导核酸酶及其他动态核酸结合蛋白，但仍存在不足。在设计目标方面，TnpB不同结构域对序列改变的耐受性不同，DNA识别相关的REC结构域对替换更敏感，未来需检验模块化设计原则是否适用于其他多结构域蛋白。

在数据条件方面，序列掩码依赖足够丰富的进化信息，对数据库中序列的多样性和代表性要求较高，更丰富、均衡的蛋白 - 核酸配对数据有助于方法推广。在机制理解方面，AI生成残基如何影响核酸结合和构象变化，仍需进一步研究，此次冷冻电镜结构捕获到的TAM结合状态，为未来研究RNA引导核酸酶的瞬时构象提供了先例。

编辑观点：诺奖团队的AI蛋白质设计成果意义重大，SynTnpB变体展现出超越天然酶的潜力，但技术仍有改进空间，未来若能解决现存问题，有望在基因编辑等领域带来更多突破。