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摘要

高质量合成宏基因组（synthetic metagenome）对于生物信息学工具基准测试、实验设计以及人工智能与机器学习标注数据生成具有基础作用。作者发布RandomReadsMG，一款随BBTools（BBTools suite）分发的开源宏基因组读段模拟器（metagenomic read simulator）。该软件可通过单条命令构建数百至50000个基因组的群落，支持用户定义丰度谱、可配置基因组内覆盖变异、保留读段溯源信息（read provenance）、测序错误及建库假象。其提供Illumina、Oxford Nanopore Technologies（ONT，牛津纳米孔技术）与PacBio平台预设。基准测试显示，RandomReadsMG在内存受限条件下于6小时内生成太字节（terabase）级数据；基于实际饮用水宏基因组丰度谱的模拟在回映射后保持基因组水平深度；受控病原掺入（pathogen spike-in）可估算读段检测与元基因组组装基因组（metagenome-assembled genome，MAG）恢复阈值。该框架适用于宏基因组基准测试、生物监测（biosurveillance）实验设计及大规模合成数据生成。

keyword宏基因组模拟（metagenome simulation）；RandomReadsMG；经验丰度谱（empirical abundance profile）；基因组内覆盖异质性（intra-genome coverage heterogeneity）；病原掺入（pathogen spike-in）；元基因组组装基因组（MAG）；读段溯源（read provenance）；Illumina/ONT/PacBio

• Bushnell B, Schulz F, Villada JC (2026). RandomReadsMG: Rapid, realistic metagenome simulation at terabase scale for benchmarking and experimental design. Cell Genomics 6, 101384. https://doi.org/10.1016/j.xgen.2026.101384
• 期刊：Cell Genomics（Cell Press/Elsevier，金色开放获取，在线ISSN 2666-979X；2026 Journal Impact Factor＝8.4，CiteScore＝14.6，遗传与基因组学Q1）
• 发表时间：2026年12月9日（online in press/issue）

研究总结

背景介绍

宏基因组分析面临数据量大、真实组成未知、基因组间与基因组内深度不均等计算问题，其中非均匀覆盖是分箱（binning）与组装（assembly）方法识别基因组边界的关键特征。既有工具如MetaSim、InSilicoSeq、CAMISIM、NanoSim、MeStanG与MeSS可依据群落组成与平台模型生成多基因组数据，但在高复杂度群落下常受运行时间、依赖复杂度和基因组内非均匀深度支持不足限制；同时，读段头保留分类起源、低丰度 organism 可控掺入等基准需求未系统纳入。作者以BBTools中的RandomReadsMG解决上述问题：将群落丰度、基因组内覆盖、平台属性与建库假象设为独立可变量，在单进程中流式读取参考基因组，面向数千至五万基因组的大规模合成数据提供可重复模拟。

重要结果

结果1 工作流程、覆盖模型与平台属性可配置

RandomReadsMG以FASTA参考基因组为输入，输出FASTQ读段；三阶段分别为基因组水平丰度分配、基因组内读段抽样、平台读段与错误/假象生成。丰度可使用MIN4、EXP、ROOT、UNIFORM内置分布或显式每基因组深度；基因组内默认均匀覆盖，可选sinewave（正弦波）模式以多正弦周期和相位产生空间相关深度变异，并以minprob控制低覆盖谷值比例。平台预设中，Illumina为双端短读与可配插入片段，ONT采用指数—对数正态混合长读分布，PacBio HiFi采用对数正态分布；错误参数、随机六聚体引物偏好、PCR重复、接头、poly-G与环形序列跨接点可独立开关。该架构使研究人员可在不变背景群落下仅改变目标物种深度、覆盖异质或平台错误。

图1图例：A为RandomReadsMG从输入FASTA到模拟FASTQ的工作流示意图，覆盖覆盖建模、平台选择、读段生成、错误模拟与选定建库假象等可配置模块。B为模拟Illumina宏基因组中基于sinewave选项沿contig生成的变深度覆盖图，使用Integrative Genomics Viewer（IGV，整合基因组浏览器）展示。C为模拟GC含量、Illumina插入片段长度以及ONT和PacBio读长分布，总结软件生成的组成与结构读段属性。

结果2 五万基因组规模下跨平台性能与内存边界

作者在1、10、100、1000、10000、50000个基因组梯度下比较RandomReadsMG与CAMISIM（ART/wgsim/NanoSim3）、MeSS（ART/PBSIM3）、MeStanG（fast/dorado）及NanoSim（training与zymo模型）。RandomReadsMG设Java堆8GB（参数-Xmx8g），五万基因组最长耗时19412秒（约5小时23分），输出达太字节级；峰值常驻内存随规模升至8GB上限后平稳。Illumina路径下其余多数工作流在1000基因组内受18小时限制未完成，MeSS（ART）在100基因组以上即超时；ONT路径下MeStanG与NanoSim（training）在约1000基因组后总产出平台化，NanoSim（zymo）至10000基因组但未达五万规模；PacBio路径下仅RandomReadsMG完成全梯度，MeSS（PBSIM3）100基因组以上未完成。结果说明文件级并行与流式处理可把峰值内存与总基因组数解耦。

图2图例：按社区复杂度（1至50000基因组，横轴对数）展示Illumina、ONT与PacBio下各工作流的经过时间、输出文件大小、峰值内存、总碱基数与总读段数（纵轴对数）。RandomReadsMG与CAMISIM、MeSS、MeStanG、NanoSim多配置比较；每点为一次运行，未重复；缺失点表示超过18小时限制未完成。图形用于比较扩展性和输出规模随基因组数的标度关系。

结果3 饮用水背景病原掺入与检测、MAG恢复阈值

作者用77个饮用水MAG（来自Sevillano等）加26个NCBI代表基因组构成103个基线基因组，以33个真实饮用水宏基因组回映射深度建立经验背景丰度；分别将Helicobacter pylori、Legionella pneumophila、Leptospira interrogans、Mycobacterium avium、Pseudomonas aeruginosa与Vibrio cholerae按0.001×至1000×共11个目标深度单独掺入，生成66个阳性数据集与1个无病原对照。回算显示观察深度与请求深度高度一致（log10 Pearson r＝0.9981，Spearman ρ＝0.9960，观察/模拟深度中位数1.001）；经metaSPAdes组装、BBMap回映射、MetaBAT2分箱、CheckM2与GTDB-Tk分类后，五种病原自4×起可获得精确种级MAG，M. avium需8×方可精确种级恢复，高质量MAG需更高深度。该设计在不假设单一未知病原丰度下给出目标物种与流程双依赖的恢复矩阵。

图3图例：A为基线饮用水群落构建工作流，含103个基因组与来自真实宏基因组的丰度估计。B为103个成员的分类与基因组特征。C为六病原按11个请求深度掺入后的绝对相对深度误差、参考覆盖分数与映射后相对丰度验证。D为经组装、映射、分箱、质量评估和GTDB-Tk分类后的病原MAG完整度与污染度随模拟深度变化，仅绘制定种成功的bin。E为66个阳性模拟各自的经过时间与RAM消耗，基线为103个基因组、丰度来自33个公共饮用水宏基因组。

结果4 经验饮用水深度谱回模拟保持丰度与覆盖结构

从33个真实饮用水样本中选低、中、高回映射比例各一例（SRR14143306映射4.31%、SRR14143297映射54.92%、SRR14143316映射91.79%），取每例CoverM平均深度最高的12个MAG/代表基因组作为目标深度谱，分别以RandomReadsMG（sinewave）与InSilicoSeq（HiSeq）模拟Illumina双端读段并回映射。RandomReadsMG回映射深度与目標深度几乎一致（每样本log10 Pearson r＝0.99994至1.0，Spearman ρ＝1.0，跨样本中位绝对百分误差0.011%）；InSilicoSeq深度保真相当，但RandomReadsMG因sinewave产生更高基因组内覆盖变异系数与略低覆盖分数。三样本选定基因组GC广幅，覆盖变异未表现主导性GC相关假象。结果支持在固定平均深度下以可配覆盖异质模拟真实宏基因组深度结构。

图4图例：A为三例真实饮用水样本按CoverM平均深度排名的12个高深度基因组经验深度谱，标注全103基因组参考集的总体回映射比例以筛选低中高样本。B为目标深度与模拟读段回映射深度的比较。C为真实覆盖分数与模拟覆盖分数比较，虚线为一致性线。D为选定基因组按GC范围计算的基因组内覆盖变异系数，GC来自参考序列，变异系数由bedtools genomecov深度直方图的标准差除以均值得到；同批基因组对RandomReadsMG与InSilicoSeq配对比较。

方法学参考

上述流程中，文件级并行仅将当前contig与每线程缓冲载入内存，峰值主要受并发活动序列总长与Java堆限制；覆盖模型分离使平均丰度、位置异质与平台错误可单独扰动。基准采用确定性随机种子，病原实验以CoverM估深度、metaSPAdes组装、MetaBAT2分箱、CheckM2估完整度/污染、GTDB-Tk定种，可作为宏基因组模拟与流程基准标准模板。

总结

RandomReadsMG将大群落宏基因组模拟的执行瓶颈从全社区内存加载转向输出量驱动的流式生成，在五万基因组、8GB堆与约5.4小时时间内提供太字节级、可溯源、可复现数据。其价值不限于速度：sinewave覆盖、显式丰度与低丰度掺入使组装、分箱、分类与生物监测深度规划可在已知真值下做单因子对照。经验饮用水验证表明，模拟深度谱回映射保真度高，而病原恢复阈值显示读段级检测、精确种级MAG与高质量MAG对深度要求不同，不能由单一灵敏度值替代。该软件可作为算法开发、教学演示与AI标注数据生成的基础设施；其局限在于sinewave为现象型覆盖模型，不显式模拟GC偏好、复制起点梯度、可映射性、提取效率或种群内株级多样性，长读错误为参数化而非从SAM/BAM学习位置上下文模型，后续可引入协议级错误推断与株混合深度控制。

参考文献

• Bushnell B, Schulz F, Villada JC (2026). RandomReadsMG: Rapid, realistic metagenome simulation at terabase scale for benchmarking and experimental design. Cell Genomics 6, 101384. https://doi.org/10.1016/j.xgen.2026.101384
• Fritz A, Hofmann P, Majda S, et al. (2019). CAMISIM: simulating metagenomes and microbial communities. Microbiome 7, 17. https://doi.org/10.1186/s40168-019-0633-6
• Gourle H, Karlsson-Lindsjo O, Hayer J, Bongcam-Rudloff E (2019). Simulating Illumina metagenomic data with InSilicoSeq. Bioinformatics 35, 521-522. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty630
• Yang C, Lo T, Nip KM, et al. (2023). Characterization and simulation of metagenomic nanopore sequencing data with Meta-NanoSim. GigaScience 12, giad013. https://doi.org/10.1093/gigascience/giad013
• Chaabane F, Pillonel T, Bertelli C (2024). MeSS and assembly finder: a toolkit for in silico metagenomic sample generation. Bioinformatics 41, btae760. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btae760
• Ramos Lopez D, Flores FJ, Espinola AS (2025). MeStanG-resource for high-throughput sequencing standard data sets generation for bioinformatic methods evaluation and validation. Biology 14, 69. https://doi.org/10.3390/biology14010069

重要网站：

• RandomReadsMG源码与BBTools：https://github.com/bbushnell/BBTools
• Zenodo归档：https://zenodo.org/records/21680000
• 编译版与容器：https://sourceforge.net/projects/bbmap/ ；https://hub.docker.com/r/bryce911/bbtools
• Cell Genomics期刊指标与投稿：https://www.sciencedirect.com/journal/cell-genomics/about/insights