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药物毒性是药物研发面临的重要问题之一，科学技术的发展赋予毒理学研究更多先进的研究工具和手段，实现了从整体水平向细胞和分子水平的飞跃，各种组学技术的发展使得对毒性药物的直接作用靶点的检测更加方便。癫痫是一种反复性突然发作的脑功能短暂异常的复杂性神经系统疾病，其发病机制尚未完全阐明。因此，迫切需要揭示癫痫的发病机制和分子靶标。羟基马桑毒素（Tutin）是从植物马桑（Cofiaria Sinica Maxim）中分离得到一种致癫痫的有毒天然产物，常用于急性癫痫模型的建立，但其具体致病机制尚未完全阐明。

2023年3月，中国医学科学院药物研究所庾石山、张丹、屈晶研究员团队在Signal Transduct Target Ther（IF=39.3）发表题为“The toxic natural product tutin causes epileptic seizures in mice by activating calcineurin”的文章，揭示Tutin直接激活钙调磷酸酶（Calcineurin, CN）诱导小鼠癫痫发作的作用机制。

作者首先尝试采用ABPP鉴定tutin的直接靶点，但由于炔烃修饰后tutin的致癫痫活性明显下降，难以保证探针对原始小分子作用特征的保留，因此进一步采用TPP进行无偏向靶点筛选。在原代海马神经元中处理tutin后，通过不同温度热处理结合质谱分析，发现钙调磷酸酶（calcineurin，CN）表现出明显的热稳定性变化。随后，CETSA进一步证实tutin能够提高CN的热稳定性，MST实验则验证了tutin与CN之间存在直接相互作用，KD为0.28 ± 0.27 μM，提示CN可能是tutin发挥生物学作用的直接靶点。

为进一步明确tutin与CN的具体结合区域，作者采用HDX-MS对tutin结合前后的CN进行氢氘交换分析。质谱结果共发现7个氘摄取存在差异的肽段，其中230–259、232–242和243–258区域表现出明显的H/D交换速率变化，且这些肽段均定位于CN催化亚基的活性位点附近，提示tutin可能直接结合于CN的催化区域并引起局部构象变化。在此基础上，作者结合HDX-MS结果进行分子对接，进一步预测CN的Arg254和Ala283可能与tutin形成关键氢键作用。随后构建R254K和A283V突变体，MST结果显示两种突变均显著降低了CN与tutin的结合亲和力，从而进一步验证了HDX-MS所提示的关键结合区域及氨基酸位点。

在确定结合位点后，作者进一步通过功能实验验证该相互作用的生物学意义。体内外实验表明tutin能够激活CN蛋白酶活性，而CN抑制剂FK506能够拮抗tutin诱导的癫痫表型；进一步敲低小鼠脑内CNA表达，也能够减轻tutin诱导的癫痫及神经元损伤。由此形成了从TPP筛选靶点 → CETSA/MST验证直接结合 → HDX-MS定位结合区域 → 分子对接预测关键残基 → 突变实验验证结合位点 → 功能实验验证靶点作用的完整证据链，其中HDX-MS在该研究中发挥了连接“直接结合验证”与“具体结合位点解析”的关键作用。

氢氘交换质谱技术如何应对实际科研中的难点

HDX‑MS 技术在蛋白结构动态、蛋白‑药物相互作用研究中应用广泛，但实验受多重因素干扰，对体系质控提出较高要求。

1. 方法建立、实验实施与后续数据处理，均需要专业技术人员完成；

2. 鉴于蛋白理化性质的差异性，需针对样本定制方案，借助预实验评价样本稳定性、序列覆盖水平，优化标记时间；

3. 样本处理、氢氘交换、酶解及质谱采集各个步骤均需要标准化管控，保障实验重现性；

4. 较高的序列覆盖率（≥80%），是准确解析结合区域与构象改变的重要前提；

5. 稳定的酶解体系有利于产生更多肽段，改善蛋白覆盖，满足后续分析标准。

如果实验室缺少相应硬件与技术积累，可以选择国内商业化平台开展整套 HDX‑MS 测试（如达吉特）

参考文献：《The toxic natural product tutin causes epileptic seizures in mice by activating calcineurin》（有毒天然产物tutin通过激活钙调神经磷酸酶诱导小鼠发生癫痫发作） Signal Transduct Target Ther. 2023;8(1):101.